Né à Porto Rico, Benicio Del Toro grandit en Pennsylvanie et fait ses études à l'université de Californie de San Diego. Il se tourne vers le théâtre à New York puis s'installe à Los Angeles avant de jouer dans ses premières séries télévisées dont MIAMI VICE (1987).

Il se fait remarquer dans THE INDIAN RUNNER de Sean Penn, MACHO de Bigas Luna, ÉTAT SECOND de Peter Weir, LUNE ROUGE de John Bailey et SWIMMING WITH SHARKS de George Huang (1991-1994).

Le succès surprise du thriller tortueux USUAL SUSPECTS de Bryan Singer (1994) le lance définitivement auprès de Kevin Spacey et Gabriel Byrne.

Il s'implique dans des films d'auteur auprès de réalisateurs à l'univers marqué et parfois déjanté : Abel Ferrara (NOS FUNÉRAILLES, 1996), Terry Gilliam (LAS VEGAS PARANO, 1998) ou Guy Ritchie (SNATCH, 2000).

Le réalisateur de SEXE, MENSONGES ET VIDÉO Steven Soderbergh lui permet d'obtenir l'Oscar du meilleur second rôle pour le choral, brillant et tendu TRAFFIC (2000).

Il devient prisé des aventures intenses : THE PLEDGE de son ami Penn (2001) et face à ce dernier dans 21 GRAMMES d'Alejandro Gonzalez Iñarritu (2003).

Il mène les thrillers WAY OF THE GUN de Christopher McQuarrie (2000) et TRAQUÉ de William Friedkin (2003) avec Tommy Lee Jones.

Solide, charismatique, magnétique, il participe au sombre et stylisé SIN CITY de Robert Rodriguez & Franck Miller (2005) avec une brochette de vedettes.

Puis il devient le Che, Ernesto Guevara, pour le diptyque de Soderbergh, CHE, L'ARGENTIN et GUERILLA (2008), avant d'incarner le loup-garou du blockbuster WOLFMAN (Joe Johnston, 2010).

Il se réchauffe auprès de Halle Berry dans l'intense NOS SOUVENIRS BRÛLÉS (Susanne Bier, 2007) et malmène Salma Hayek et Blake Liveky dans SAVAGES (Oliver Stone, 2012).