Nathalie Boutefeu passe par le Conservatoire de Strasbourg de 1989 à 1992. Elle joue régulièrement sur scène, Bernstein, Ibsen, Tennessee Williams, Edward Bond, Schnitzler, Marivaux, Racine ou Shakespeare.

Muse des jeunes réalisateurs de court métrage (Mathieu Amalric, Sophie Fillières, Valérie Gaudissart), elle début au long métrage avec CONFESSIONS D'UN BARJO de Jérôme Boivin (1992), puis elle est repérée par de grands auteurs.

D'Olivier Assayas (UNE NOUVELLE VIE, 1993, IRMA VEP, 1996) à Pascal Bonitzer (RIEN SUR ROBERT, 1999), de Michel Deville (LA MALADIE DE SACHS, 1999) à Patrice Chéreau (SON FRÈRE, 2003) et Arnaud Desplechin (ROIS ET REINE, 2004).

Brune au charmant minois, elle campe avec aplomb et sensibilité à fleur de peau des jeunes femmes de son temps. Des sœurs, (petites) amies, collègues ou serveuses indispensables, qu'on remarque au premier coup d'œil.

Loin de n'être qu'une égérie franco-française, elle séduit les latins Marco Bellocchio (RÊVE DE PAPILLON, 1994), Raoul Ruiz (LES ÂMES FORTES, 2001) et Marc Recha (PAU ET SON FRÈRE, 2001), ainsi que le Japonais Nobuhiro Suwa (UN COUPLE PARFAIT, 2005).

Elle trouve aussi en Jérôme Bonnell un complice privilégié, qui l'emmène dans ses courts (FIDÈLE, 1999 ; LISTE ROUGE, 2000) et dans ses longs. LE CHIGNON D'OLGA (2001) et LES YEUX CLAIRS (2004), où elle fait sensation dans la peau d'une héroïne sensorielle et décalée.

Dans J'ATTENDS QUELQU'UN (2007), elle crée une femme au chien, burlesque, qui traverse le film en pointillés, et dans LA DAME DE TRÈFLE (2009) elle fait face à Florence Loiret-Caille et Malik Zidi.

Avec Sébastien Betbeder, elle croise aussi un auteur à l'univers esthétique singulier, qui l'invite au court (NU DEVANT UN FANTÔME, 2005), au moyen (LES MAINS D'ANDRÉA, 2006) et au long métrage NUAGE (2007). Elle campe dans ce dernier film, Clara, la fille d'un photographe qui vit à l'« Orée du Bois ».

Toujours discrète, elle intègre l'univers de Marie Vermillard (SUITE PARLÉE, cosigné Joël Brisse), accompagne Sylvie Testud alias LOUISE MICHEL LA REBELLE (Solveig Anspach) et visite Delphine Gleize (LA PERMISSION DE MINUIT) et Joachim Lafosse (A PERDRE LA RAISON, (2010-2012).