Né en Corée, John Cho grandit à Los Angeles, où il obtient un diplôme en littérature anglaise à Berkeley.

Il court également les scènes avec divers spectacles, avant d'apparaître à la télévision dès 1997 des séries (FELICITY, V.I.P., CHARMED, LES 7 MERCENAIRES), mais aussi dans DES HOMMES D'INFLUENCE (Barry Levinson, 1997).

Puis il promène sa silhouette dans des films de premier plan, tels AMERICAN BEAUTY (Sam Mendes, 1999), EVOLUTION (Ivan Reitman, 2001) et SOLARIS (Steven Soderbergh, 2002), comme dans le drame romantique sino-américain PAVILION OF WOMEN (Ho Yim, 2001) avec Willem Dafoe. Mais c'est la comédie qui le fait connaître.

Il tient des petits rôles dans BOWFINGER ROI D'HOLLYWOOD (Frank Oz, 1999) et LES PIERRAFEU A ROCK VEGAS (Brian Levant, 2000).

Il devient un visage familier de Chris & Paul Weitz qui l'embarquent dans la saga AMERICAN PIE (1999, 2001, 2012), LES PIEDS SUR TERRE (2001), EN BONNE COMPAGNIE (2004), AMERICAN DREAMZ (2006) et dans la série comique OFF CENTRE/SEXE & DEPENDANCES (2001-2002).

Bourreau de travail, il porte le délirant SEE THIS MOVIE (David M. Rosenthal, 2004) et mène avec Kal Penn le duo délirant de la saga HAROLD & KUMAR ... créée par Jon Hurwitz et Hayden Schlossberg (2004, 2008).

Il traverse BAM BAM AND CELESTE de Lorene Machado (2005) et SMILEY FACE de Gregg Araki (2007).

Il apparaît aussi en invité dans les séries DR HOUSE (2005), GREY'S ANATOMY (2006), dans plusieurs épisodes de KITCHEN CONFIDENTIAL (2005-2006) et UGLY BETTY (2007).

Dans un registre plus sombre, il intègre la bande de BETTER LUCK TOMORROW (Justin Lin, 2002) et traverse THE AIR I BREATHE (Jieho Lee, 2007) avec Sarah Michelle Gellar, Brendan Fraser et Andy Garcia.

Il se marie en 2006 avec Kerri Higuchi, apparue dans PLUS JAMAIS de Michael Apted (2002), « Urgences » et « Grey's Anatomy ».

Il porte le polar américano-coréen WEST 32ND de Michael Kang (2007).

La célébrité mondiale arrive avec deux sagas fantastiques : sur grand écran dans la peau d'Hikaru Sulu pour les blockbusters de J.J. Abrams STAR TREK (2009) et STAR TREK INTO DARKNESS (2012).

Et sur petit écran dans la série FLASHFORWARD (Brannon Braga & David S. Goyer, 2009-2010, photo) où il incarne Demetri Noh face à Courtney B. Vance et Joseph Fiennes.